Automatizzazione della generazione di iPSC per consentire la terapia di sostituzione cellulare autologa dei fotorecettori

Journal of Translational Medicine volume 21, numero articolo: 161 (2023) Citare questo articolo

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La degenerazione retinica ereditaria è una delle principali cause di perdita incurabile della vista nel mondo sviluppato. Sebbene la sostituzione autologa delle cellule dei fotorecettori mediata da iPSC sia teoricamente possibile, la mancanza di tecnologie disponibili in commercio progettate per consentire la produzione parallela ad alto rendimento di terapie specifiche per il paziente ha ostacolato la traduzione clinica.

In questo studio, descriviamo l'uso della piattaforma di coltura cellulare robotica di precisione Cell X per consentire la produzione parallela di iPSC specifiche per il paziente di grado clinico. La cellula X è alloggiata all'interno di un isolatore asettico chiuso conforme a ISO Classe 5 cGMP (Biospherix XVivo X2), dove sono state eseguite tutte le procedure, dalla coltura dei fibroblasti alla generazione di iPSC, all'espansione clonale e alla differenziazione retinica.

Le iPSC dei pazienti generate utilizzando la piattaforma Cell X sono state determinate come pluripotenti tramite l'analisi delle carte di punteggio e geneticamente stabili tramite il cariotipo. Come determinato tramite immunocolorazione e microscopia confocale, gli iPSC generati utilizzando la piattaforma Cell X hanno dato origine ad organoidi retinici indistinguibili dagli organoidi derivati ​​da iPSC generati manualmente. Inoltre, 120 giorni dopo la differenziazione, l'analisi di sequenziamento dell'RNA di singole cellule ha rivelato che le cellule generate utilizzando la piattaforma Cell X erano paragonabili a quelle generate in condizioni manuali in un laboratorio separato.

Abbiamo sviluppato con successo una piattaforma robotica di generazione di iPSC e procedure operative standard per la produzione di cellule precursori di fotorecettori di alta qualità compatibili con le attuali buone pratiche di produzione. Questo sistema consentirà la produzione di grado clinico di iPSC per la sostituzione autologa delle cellule retiniche.

Dal primo trapianto di rene riuscito tra gemelli identici nel 1954 [1], il campo della medicina rigenerativa è fiorito. Il trapianto di organi solidi HLA compatibili è ormai un luogo comune e salva migliaia di vite ogni anno [2, 3]. Il successo del trapianto di organi solidi può essere in parte attribuito al fatto che il tessuto rimane vitale per un lungo periodo post-raccolto e che è possibile ristabilire connessioni funzionali con l’ospite attraverso una combinazione di microchirurgia e sistema nervoso periferico (PNS). reinnervazione. A differenza degli organi periferici, i tessuti maturi del sistema nervoso centrale (SNC) non beneficiano degli stessi vantaggi. Nello specifico, i tessuti del sistema nervoso centrale subiscono danni irreversibili entro pochi minuti dalla perdita della perfusione. Inoltre, a causa delle proprietà intrinseche sia dell’ambiente che della cellula, la capacità di rigenerarsi dei neuroni maturi del sistema nervoso centrale è limitata. Ad esempio, in seguito al trapianto sottoretinico in topi degenerati della retina, fogli intatti di cellule fotorecettrici mature non riescono ad estendere gli assoni o a stabilire connessioni sinaptiche con gli interneuroni retinici dell’ospite [4]. Al contrario, lo sviluppo di cellule progenitrici della retina può facilmente integrarsi con la retina ospite distrofica dopo il trapianto [5]. Per questo motivo, noi e altri abbiamo concentrato la nostra attenzione sullo sviluppo di strategie di sostituzione delle cellule dei fotorecettori basate su cellule staminali per il trattamento di pazienti con cecità degenerativa retinica [6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23].

Sebbene le cellule progenitrici della retina e i precursori dei fotorecettori postmitotici siano in uno stadio di sviluppo appropriato per il trapianto di retina [5, 24,25,26,27], queste cellule possono essere raccolte solo dalla retina di un donatore fetale in stadio avanzato, il che le rende eticamente sfavorevoli e difficili da ottenere. ottenere in numero sufficiente per essere clinicamente praticabili. Piuttosto che isolare le cellule progenitrici della retina da un feto in via di sviluppo, il settore ha concentrato gran parte della sua attenzione sullo sviluppo di protocolli progettati per guidare la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti nei tipi cellulari desiderati [28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44].